RACE = rapid amplification of cDNA ends

PCRを応用してcDNAの3'-末端を取得する方法である。
以下の例で使用しているキットは5'-full RACE core set (Takara-bio)である。

☆Protocol!☆

 ○コンカテマー化cDNAの調製

1) 試料とするtotal RNAを精製。最低1 μg必要

2) 標的遺伝子の既知配列をもとに、12-15 merの5’-リン酸化したantisense primer (AS-P)を合成する

3) 反応系(total 15 μL、200 μL容のPCR tube)
 　  1.5 μL　　10×RT Buffer 
 　　 1 μL　　AMV reversetranscriptase XL (5 U)
 　  0.5 μL　　RNase inhibitor (20 U)
　　  1 μL　　AS-P primer (200 pmol/µL)
 　   12 μL　　total RNA (2 μg) + nuclease free H2O

 3) Thermal Cyclerで逆転写反応を行う。
　　30℃、10分→50℃、60分→80℃、2分→4℃、hold（1サイクルのみ）

 4) 反応後、下記のものを添加する。

　     15 μL　　5 x Hybrid RNA Degradation Buffer
 　　45 μL　　dH2O
 　　  1 μL　　RNase H

 5) Thermal CyclerでRNase反応を行う。
       30℃、60分→4℃、Hold（1サイクルのみ）

6) 反応後、下記のものを添加する（エタノール沈殿）。

 　　25 μL　　dH2O
 　　10 μL　　3M AcONa (tapping)　
 　  250 μL　　EtOH (tapping)　
 　  　1 μL　　Glycogen (tapping)

7) 12,000 rpm, 4℃で30分遠心、沈殿をリンス、風乾

8) 沈殿を12 μL dH2O で溶解後、下記のものを添加する。

 　　  8 μL　　5x RNA Ligation Buffer　
 　    20 μL　　40% PEG600 (Pipetting)　
 　  　1 μL　　T4 RNA Ligase (Pipetting)

9) 15℃でovernight反応させる。これを直接PCRの鋳型に用いる。

 ○PCRによる目的断片の獲得

コンカテマー化した鋳型を用いてPCRを行って目的断片を得るため、inverse PCRを行うときのように本来の向きとは逆方向にprimerを設計する必要がある。また、nested PCRを実行しないとうまく行かないことが多い。

上記をふまえ、2セットのプライマーを用意する。

1) 既知配列上流に、antisense primer-1, そのさらに上流に、antisense primer-2

2) 既知配列上、AS-Pよりやや上流に、sense primer-2, そのさらに上流に、sense primer-1

1st PCRはコンカテマー化したcDNAを1~10 µL、sense primer-1、antisense primer-1（おのおの20 pmol/µLを1 µL程度）を用いる。反応条件は場合により異なるので、最適化する。

2nd PCRは1st PCR溶液を1 µL（場合によっては10~100倍まで滅菌水で希釈する）、sense primer-2、antisense primer-2（おのおの20 pmol/µLを1 µL程度）を用いる。反応条件は場合により異なるので、最適化する。