•凍結融解法用です

•本法ではLBA4404株を用いた

準備するもの

・YEB培地

•YEB+Str(100 mg/L) plate

•20mM CaCl2(オートクレーブ滅菌したもの)

•液体窒素

※StrはRif(100 mg/L)でもOK

※Str(or Rif)はヘルパープラスミドを持つ物を選抜するために添加する

YEB培地の調製

1 M MgSO4を調整し、濾過滅菌する。

Beef Extract　2.5 g

Yeast Extract 0.5 g

Bacto Pepton 0.5 g

Sucrose 2.5 g

10 N NaOH 50μL

を脱塩水 約300 mLにスターラで完全に溶かす。

500 mLにメスアップ

•YEB Agrを作る時はBacto Agar 6 gを加える(1.2%)。

オートクレーブ

滅菌済み1 M MgSO4 600μLを添加し、よく攪拌する。

•Beef Extractは容器に直接計り取る

操作（全て無菌操作）

1．白金耳でLBA4404株 グリセロールストックをYEB+Str plateに播種

　　アルミ箔で覆い遮光培養(28℃、2-3日)

2．白金耳でシングルコロニーを採り、3 mL YEB培地に接種し、振盪培養(28℃ 200 rpm 1-2日)

3．培養液2mLを採り、40 mLのYEB+Str(100mg/L)培地の入った坂口フラスコに移し、振盪培養(28℃ 200rpm)

　OD600の値がおよそ0.8になるまで培養する（4-8hrくらいかかる）。

4．培養液を氷上で冷却

　 培養液30mLを遠沈管に移し、遠心（4000rpm 4℃ 10min）

　 上澄み液を捨てる(※オートクレーブ後廃棄)

5．沈殿を氷冷しておいた20 mM CaCl2 1mLに懸濁

　　1.5 mL容エッペンチューブに200μLずつ分注

　　液体窒素で急冷

6．-80℃で数ヶ月保存可