ノーザンブロット
１）RNAを電気泳動したゲルを、2枚重ねて両袖を20×SSCに浸した3MM濾紙の上に載せる

２）ゲルの大きさより上下左右それぞれ2 mmずつ短く切っておいたHybond-N+をゲルの上に載せる

３）サンプルスロットの位置に印をする

４）フィルターの大きさより上下左右それぞれ2 mmずつ小さく切っておいた3MM濾紙を２枚フィルターの上に載せる

５）更に上下左右それぞれ2 mmずつ小さく切っておいたペーパータオルを5 cm程重ねて載せる

６）板と重しを載せ、12時間以上静置

７）ペーパータオルと濾紙を捨て、ゆっくりとフィルターを剥がす

８）2× SSCの入った容器にフィルターを移す

９）10分間緩やかに振盪

１０）3MM濾紙上に移し、室温で30分間乾燥

１１）クロスリンカーでブロット面にUV照射

１２）直ぐに使わないときはハイブリバッグに封入して保存

サザンブロット
１）DNAを電気泳動したゲルを酸変性液（0.25 N HCl）に浸漬

２）室温で7～10分間緩やかに振盪

３）脱塩水で洗浄

４）アルカリ変性液に浸漬

５）室温で15分間緩やかに振盪

６）アルカリ変性液に浸漬

７）室温で15分間緩やかに振盪

８）脱塩水で洗浄

９）中和液に浸漬

１０）室温で30分間緩やかに振盪

１１）両袖を10×SSCに浸した3MM濾紙の上にゲルを載せる

１２）ゲルの大きさより上下左右それぞれ2 mmずつ短く切っておいたHybond-N+をゲルの上に載せる

１３）サンプルスロットの位置に印をする

１４）フィルターの大きさより上下左右それぞれ2 mmずつ小さく切っておいた3MM濾紙を２枚フィルターの上に載せる

１５）更に上下左右それぞれ2 mmずつ小さく切っておいたペーパータオルを5 cm程重ねて載せる

１６）板と重しを載せ、4～20時間静置

１７）ペーパータオルと濾紙を捨て、ゆっくりとフィルターを剥がす

１８）3MM濾紙上に移し、60℃で10分間通風乾燥

１９）クロスリンカーでブロット面にUV照射

２０）分子量マーカーのバンドに鉛筆で印をする

２１）直ぐに使わないときはハイブリバッグに封入して保存

ドットブロット
ドットブロッターを用いての核酸のブロットをすることが出来る。ここでは、RNAをサンプルとして用いる時の方法について述べる。

なお、ドットブロッターはSANPLATECの製品を用いている。

１）ブロッターの面積よりやや広めにHybond-N+フィルターと3MM濾紙を切っておく

２）フィルターを滅菌水で湿らせる

３）フィルターを20× SSCに室温で1時間浸す

４）この間にドットブロッターを過酸化水素水（原液）処理による滅菌を行う。処理後、DEPC処理水ですすいだ後に0.1 N NaOHで各スロットを慎重に洗浄

５）Vacuum Unitの上に20× SSCを含ませた3MM濾紙を載せる

６）フィルターをSample Wellの底にセット（泡が入らないように注意）

７）止め金で止め、吸引器を接続

８）サンプルスロットを10×SSCで満たす

９）緩やかに吸引し、スロットの溶液を全て流す

１０）吸引器を止め、サンプルスロットを10× SSCで満たす。この後サンプル溶液を調製

１１）緩やかに吸引し、スロットの溶液を全て流す

１２）吸引器を止め、サンプル溶液をスロットに入れる

１３）緩やかに吸引し、スロットの溶液を全て流す

１４）各スロットを10× SSCで洗浄（2回）

１５）溶液が無くなってから5分間吸引し続け、乾燥

１６）ブロッターを解体し、フィルターを外す

１７）3MM濾紙上で自然乾燥

１８）クロスリンカーでブロット面にUV照射

１９）直ぐに使わないときはハイブリバッグに封入して保存

・ノーザンドットブロット用のサンプル溶液の調製

１）RNAサンプルをエタノール沈澱、リンス

２）10 μlのDEPC処理水に溶解

３）100% ホルムアミドを20 μl、7μl ホルマリン、2μl 20×SSCを加え、混合

４）68℃に15分間保持

５）3分間氷冷し、80μl 20×SSCを加え、混合