挿入したいDNAの断片をリン酸化しておくことによって、脱リン酸化したベクターとのライゲーション効率が向上する。その様な目的で、T4 polynucleotide kinaseによるリン酸化は行われる。

なお、TaKaRaの製品（10 U/μl）の系で記載してある。

１）減圧乾燥したDNAサンプルを42 μlの滅菌水に溶解

２）5 μlの10× T4 polynucleotide kinase Buffer、2.5 μlの10 mM ATP、0.5 μlのT4 PNKを加え、緩やかに混合

３）37℃に10分間インキュベート

４）65℃に10分間保持して酵素を失活

５）フェノール／クロロホルム抽出

６）クロロホルム抽出

７）エタノール沈澱、リンス、減圧乾燥