cDNAは1本鎖と2本鎖で用いることがあるが、cDNA Libraryを作る場合をのぞき、2本鎖で用いることはまれである。RT-PCRなどに用いる場合には1本鎖用のキットを用いること（2本鎖用のキットが中途半端になくなるので）。

Step 1 RNA抽出
 

別ページ参照。

Step 2 DNase処理

 

DNase処理を行っておかないと、genomic DNAのコンタミネーションの影響を避けられない。必ず行うこと。

 　　39 μL　　total RNA (5 µg) + dH2O
 　　  5 μL　　10x DNase buffer　
 　      5 μL　　BSA (2 µg/µL)
 　  　1 μL　　DNase

       37℃、30分→70℃、3分→4℃、Hold（1サイクルのみ）

反応後、フェノクロ抽出を行って、エタノール沈殿により回収する。適宜RNase free水に溶解して濃度を測定後、次のステップへ。

Step 3 cDNA合成

 

1st Strand cDNA synthesis: SuperScriptIII cDNA Synthesis Kit（Invitrogen）

１）サーマルサイクラーを用いて次の反応を行う（annealing)。

 　　  8 μL　　total RNA (500 ng, DNase処理済) + dH2O
 　　  1 μL　　dNTP
 　  　1 μL　　Random Primer/Oligo dT primer

       65℃、5分→4℃、Hold（1サイクルのみ）

２） サーマルサイクラーを用いて次の反応を行う（Reversetranscription）。

 　　10 μL　　1)の反応液
 　　  2 μL　　10x RT buffer　
 　      4 μL　　25 mM MgCl2
 　  　2 μL　　0.1 M DTT
 　      1 μL　　RNase OUT
 　  　1 μL　　SuperScript III

       50℃、50分→85℃、5分→4℃、Hold（1サイクルのみ）

３）サーマルサイクラーを用いて次の反応を行う（RNA分解）。

 　　  20 μL　　2)の反応液
 　　   1 μL　　RNase H
       37℃、20分→4℃、Hold（1サイクルのみ）

2nd Strand cDNA synthesis: cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）

１）1.5 ml容の高速遠心チューブに10 μlの5×1st strand synthesis buffer、5 μlのRNase Inhibitor、5 μlのdNTP mixture、5 μl Oligo dT18、10 μl DEPC処理水を入れて、緩やかに混和

２）単離したmRNAのエタノール沈澱物に10 μlのTE溶液を加えて溶解

３）これを１）のcDNA合成溶液に加え、緩やかに混和

４）5 μlの RAV-2 RTase (20 U/μl)を加え、緩やかに混和

５）室温に10分間静置

６）42℃に60分間インキュベートしてmRNAからDNAへの逆転写反応を行った後、氷冷

７）反応後のチューブに50 μlの5× 2nd strand synthesis buffer、102.5μl DEPC処理水を加える

８）32.5μl E. coli DNA polymerase 、5μl E. coli ribonuclease H / E. coli DNA Ligase Mixtureを加え、緩やかに混和

９）12℃に60分インキュベート

１０）22℃に60分インキュベート

１１）70℃に10分インキュベート

１２）反応液に10μlのT4 DNA polymeraseを加え、緩やかに混和

１３）37℃に10分間インキュベート

１４）25μl の0.25 M EDTA (pH 8.0)と25μl の10% SDSを加え、反応を停止

１５）フェノール／クロロホルム抽出を２回反復

１６）水層についてクロロホルム抽出

１７）水層に1/2容の7.5 Mの酢酸アンモニウム、2容のエタノールを加え、エタノール沈澱の状態で-20℃に保存