Hanahan法（Hanahan, 1983）

１）M9寒天プレート上の単一コロニーを炎熱滅菌した白金耳に接触し、5 mlのM9最少培地に接種

２）37℃で一晩振盪培養

３）100 mlのψB培地の入った500 ml容三角フラスコへ２）の種培養液1 mlを加える

４）37℃で振盪培養

５）濁度（A600）が0.5～0.7になったら氷冷

６）50 mlずつ遠心管に分け、6000 r.p.m.、室温で5分間遠心

７）沈澱に20 mlのTfb（30 mM酢酸カリウム、100 mM RbCl、10 mM CaCl2、50 mM MnCl2、15% (v/v) Glycerol）を加え、氷冷しながら緩やかに溶解

８）1時間氷冷

９）3000 r.p.m.、室温で5分間遠心

１０）沈澱に2 mlのTfb（10 mM MOPS、10 mM RbCl、75 mM CaCl2、15% (v/v) Glycerol）を加え、氷冷しながら緩やかに溶解

１１）一本にまとめ、30分間氷冷

１２）100 μlずつ高速遠心チューブに分注し、直ぐさま液体窒素で凍結

１３）-80℃で融解しないよう保存

井上・野島法（Inoue et al., 1990）

１）LB寒天プレート上の単一コロニーを炎熱滅菌した白金耳に接触し、3 mlのSOB培地に接種（このときMg2+を添加することを忘れないように=使用時添加のこと）

２）26.5℃で18時間振盪培養

３）150 mlのSOB培地の入った500 ml容三角フラスコへ２）の種培養液600μlを加える（このときMg2+を添加することを忘れないように=使用時添加のこと）

４）26.5℃で振盪培養（5～6時間）

５）濁度（A600）が0.1～1.0（出来れば0.4～0.8）になったら氷冷、10分間

６）50 mlずつ遠心管に分け、3000 r.p.m.、4℃で15分間遠心

７）沈澱に50 mlのTransformation Buffer（10 mM PIPES、15 mM CaCl2、250 mM KCl）を加え、氷冷しながら緩やかに溶解（1本にまとめる）

８）10分間氷冷

９）3000 r.p.m.、4℃でで15分間遠心

１０）沈澱に12 mlのTransformation Bufferを加え、氷冷しながら緩やかに溶解

１１）少しづつDMSOを加える（合計840 μl）

１２）10分間氷冷

１３）1.5 ml容高速遠心チューブに100 μlづつ分注し、ふたをした後即座に液体窒素につける

１４）そのまま-80℃で融解しないよう保存

いずれの方法で作成した場合も、うまくいったかどうかの確認が必要。pBluescriptなどの精製dsDNAプラスミドを用いて形質転換を行い、一本のチューブあたり10,000,000 cfu/migro-g以上の形質転換能がなくては実用的でない。また、全くプラスミドを入れないコントロール実験を行って、コロニーが出現しないことも確認すること。