液体培養法

１）予め、溶菌が6～12時間で起きるような培養系を決めておく

２）2.5 ml宿主菌懸濁液（10 mM MgSO4）に適量のλファージを接種

３）37℃に20分間保持

４）50 ml NZYMM培地に接種

５）37℃で振盪培養、6～12時間

６）完全溶菌後1時間で振盪を止め、2.9 g NaClを加えて溶解

７）400μlクロロホルムを加えて10分間振盪、37℃

８）10000 r.p.m.、4℃で10分間遠心

９）上清に10 mlの50% PEG#6000を加え、混合

１０）1～2時間氷冷

１１）12000 r.p.m.、4℃で20分間遠心

１２）沈澱にTMN溶液（10 mM Tris-HCl、5 mM MgCl2、50 mM NaCl、pH 7.5）400μl加え、懸濁

１３）1.5 ml容高速遠心チューブに移し、2μl RNase A (20 mg/ml)、8μl DNase I (5 mg/ml)を加え、緩やかに混合

１４）37℃に30分インキュベート

１５）クロロホルム抽出、２回

１６）400μlの2×STE（80 mM Tris-HCl、2% SDS、40 mM EDTA、pH 7.5）、80μlのproteinase K (10 mg/ml)を加え、混合

１７）65℃に10分間保持

１８）フェノール抽出

１９）フェノール／クロロホルム抽出

２０）エタノール沈澱、リンス

２１）100μlの滅菌水に溶解

２２）25μl 10 M LiClを加え、混合

２３）-80℃に1時間保持

２４）融解してから、12000 r.p.m.、4℃で20分間遠心

２５）上清を取り、PEG沈澱、リンス

２６）適量の滅菌水に溶解、-20℃に保存

Plate Lysate法（Qiagen Lambda mini kitによる抽出）

１）予め、全面溶菌が一晩の培養で起きるような培養系（ファージ濃度と宿主菌液量）を決めておく

２）宿主菌懸濁液（10 mM MgSO4）に適量のλファージを接種

３）37℃に20分間保持し、予め溶解して45℃に保温しておいたNZYMMトップアガロース2.5-3 mL（角形シャーレの時は6-8 mL）に懸濁

４）直径9cm（または9 x 13 cm 角形）シャーレ上のNZYMM培地の上に３）のトップアガロースを均一にまく

５）室温でトップアガロースを固まらせた後（およそ15分）37℃で一晩静置培養

６）全面溶菌後5 mL（角形シャーレの時は10 mL）のSM bufferをかけ、一晩静置

７）コンラージ棒で寒天培地をこするようにしてSM bufferを集め、ピペットで回収（場合によっては少量のSM bufferで洗い、洗浄液も同様にして回収）

８）12,000 r.p.m.、4℃で5分間遠心

９）上清に30μlのBuffer L1を加え（溶菌液10 mLに対して。以下同じ）、混合

１０）37℃に30分インキュベート

１１）2 mL Buffer L2 (ice-cold)を加え、緩やかに混合

１２）11,000 r.p.m.、4℃で10分間遠心

１３）沈澱に1 mL Buffer L3を加え、ファージを再懸濁する

１４）1 mL Buffer L4を加え、緩やかに混合

１５）70℃に10分間インキュベート

１６）2-3分間氷冷

１７）1 mL Buffer L5をくわえ、迅速かつ緩やかに混合

１８）14,000 r.p.m.、4℃で30分間遠心

１９）上清を別のチューブに移す

２０）14,000 r.p.m.、4℃で10分間遠心

２１）２０）の遠心の間にQiagen Tip-20を立てて置いて、1 mL Buffer QBTを滴下してカラムを平衡化

２２）Buffer QBTが落ちきってから、２０）の上清をカラムにゆっくり滴下

２３）1 mL Buffer QCを乗せ、洗浄（2回行う）

２４）溶出液を回収するためのチューブをカラム下に取り付けてから、1.5 mL Buffer QFを乗せる

２５）溶出液を回収。回収された溶出液量の0.7 vol.のisopropanolを加える

２６）14,000 r.p.m.、4℃-室温で30分間遠心

２７）沈澱をrinse、風乾する（減圧乾燥不可）