Protocols
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1) 凍結(-80℃)植物体サンプル(5g)を液体窒素と共に乳棒・乳鉢を用いて粉砕
2)50 ml容 遠心管にうつし、5 mlの2xCTAB(2% (w/v) Cetyl trimethyl ammonium bromide( 以後、CTABと記す)、0.1 M Tris-HCl、1.4 M NaCl、1% (w/v) PVP、pH 8.0)を加える
3)55℃ で10分間インキュベート
4)5 mlのクロロホルム(以後、Chlと記す)/イソアミルアルコール(以後、Isoと記す)溶液(Chl:Iso=24:1)を加え、室温で30分間振盪
5) 10,000 r.p.m 、室温で15分間遠心
6) 上層を別の50ml容遠心管に移す
7)下層に5mlの1xCTAB(2xCTABを2倍に希釈したもの)を加え、室温で10分振盪
8)10,000 r.p.m 、室温で15分間遠心
9)上層を6)の遠心管に移す
10)等容の Chl/Isoを加え、室温で10分間振盪
11)10,000 r.p.m 、室温で10分間遠心
12)上層を別の50 ml容遠心管に移す
13)1/10容の10%CTAB(10% (w/v) CTAB、0.7M NaCl)を加え、完全に溶かす
14)等容のPpt Buffer(1%CTAB、5 mM Tris-HCl、10 mM EDTA、pH 8.0)を加え、転倒混和し、30分間以上放置
15)10,000 r.p.m 、室温で10分間遠心
16)上層を捨て、1/4容の1 M NaCl-TE(1 M NaCl、10 mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 8.0)を加える
17) 55℃で沈殿が溶けるまでインキュベート
18)等容のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和
19)10,000 r.p.m 、室温で10分間遠心
20)リンス、風乾
21)沈澱が溶解するのに適量のTEを加え、55℃で溶解
22)1/10容 10xRNase(10μg/ml RNase A)を加え、55℃ で30分間インキュベート
23)フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱、リンス後、適量のTEに溶かして-20℃保存
植物のgenomic DNAの抽出 (CTAB法)
Wednesday, February 13, 2008