Protocols
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1)凍結(-80℃)植物体サンプルを液体窒素と共に乳棒・乳鉢を用いて粉砕
2)20 mlの抽出バッファー(1.5% (w/v) Sucrose、50 mM Tris-HCl、50 mM EDTA、5 mM NaCl、pH 8.0)中に懸濁
3)50 ml容遠心管に入れ、500 r.p.m.、室温で3分間遠心
4)沈澱に2T-1E(20 mM Tris-HCl、10 mM EDTA、pH 8.0)を12 ml加え、激しく撹拌
5)10% (w/v) SDSを1.6 ml加え、激しく撹拌
6)70℃に15分間処理
7)7.5 M 酢酸アンモニウムを6 ml加え、激しく撹拌
8)30分間氷冷
9)15000 r.p.m.、4℃で15分間遠心
10)上清にイソプロパノールを28 ml加え、激しく撹拌
11)室温に15分間放置
12)析出した白い沈澱をパスツールピペットの先で巻き取って回収、15 ml容遠心管に移す(この操作が不可能なときは遠心分離により回収)
13)リンス
14)TE溶液に溶かしたRNase A (20μg/ml) を5 ml加え、掻き混ぜずに4℃に一晩放置して、溶解
15)5 mlのTE溶液を加え、55℃に30分間処理(RNase Aの失活)
16)2.5 mlの10 M LiClを加え、転倒混和
17)-80℃に30分間インキュベート
18)常温に戻した後、12000 r.p.m.、4℃で15分遠心
19)上清をとり、等量のイソプロパノールを加える
20)室温に15分間放置
21)析出した白い沈澱をパスツールピペットの先で巻き取って回収、15 ml容遠心管に移す(この操作が不可能なときは遠心分離により回収)
22)リンス
23)オートピペットを使用してエタノールを除去(減圧乾燥しない)
24)適量のTE溶液に溶解(一晩かけ、撹拌せずに溶解)
25)-20℃に保存
植物のgenomic DNAの抽出 (SDS法)
Wednesday, February 13, 2008