SUPREC01 (Takara-bio); 切り出したゲルからの抽出

１）電気泳動後、EtBr染色したゲルをUV照射により確認し、欲しいバンドだけを鋭利な刃物で切り抜く

２）SUPREC01（TaKaRa）に切り抜いたゲルを細かくして入れる

３）-80℃で凍結、5分以上

４）37℃で融解、5分以上

５）10000 r.p.m.、4℃で10分間遠心

６）200 μlのTE溶液を重層

７）10000 r.p.m.、4℃で10分間遠心

８）フィルターを除去、フェノール抽出

９）フェノール／クロロホルム抽出

１０）クロロホルム抽出

１１）エタノール沈澱、リンス、減圧乾燥

SUPREC02 (Takara-bio); 高分子DNAの濃縮

１）プローブ調製後、反応を停止した溶液に400 μlになるようにTEを加える

２）SUPREC02（TaKaRa）のフィルターカップに溶液を注入

３）卓上遠心機（ちびたん）で8分間遠心

４）ろ液を捨てる。カップ上に400 μl TEを加える

５）卓上遠心機（ちびたん）で8分間遠心

６）ろ液を捨てる。カップ上に400 μl TEを加える

７）卓上遠心機（ちびたん）で8分間遠心

８）さらに遠心して必要な液量になったところでやめる

９）カップ内液を別のチューブに移し、-20℃に保存

なお、遠心3回を行う系で書いてあるが、2回だけでも十分なことが多い。

QIAquick PCR purification kit (Qiagen); PCR産物の精製

*このプロトコールでの遠心は12000 x g, 室温が基本。

１）PCR反応液に、5 倍量のBuffer PB を加える

２）QIAquick spin column を添付の 2 ml collection tubeとともにチューブラックにセット

３）１）の試料全部をQIAquick columnに載せ、30~60 s遠心する

４）通過液を捨てQIAquick column を元のチューブに戻す

５）0.75 ml Buffer PE をQIAquick column に加え、 30~60 s遠心する

６） 通過液を捨てQIAquick column を元のチューブに戻し、さらに60 s遠心する。ここで完全にbuffer PEに含まれるエタノールを除去する

７）QIAquick column を新たな 1.5 ml microcentrifuge tubeにセットする

８）下記どちらかの方法でDNAを溶出する。

    ８−１）50 µl Buffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) または H2O をQIAquick membrane の中心に載せ、60 s遠心する。

    ８−２） 30 µl Buffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) または H2O をQIAquick membrane の中心に載せ、60 s静置後、60 s遠心する。

PureLink PCR purification kit (Invitrogen); PCR産物の精製

*このプロトコールでの遠心は10000 x g, 室温が基本。

１）PCR反応液に、4 倍量のPureLink Binding Buffer を加える

２）PureLink spin column を添付の 2 ml collection tubeとともにチューブラックにセット

３）１）の試料全部を PureLink spin column に載せ、60 s遠心する

４）通過液を捨て PureLink spin column を元のチューブに戻す

５）0.65 ml Wash Buffer を PureLink spin column に加え、 60 s遠心する

６） 通過液を捨てQIAquick column を元のチューブに戻し、さらに1-2 min遠心する。ここで完全にWash Bufferに含まれるエタノールを除去する

７） PureLink spin column を添付の1.7 ml microcentrifuge tubeにセットする

８）50 µl Elution Buffer または H2O を PureLink spin column の中心に載せ、60 s静置後、2 min 遠心する。