従来法

１）下記のMaster Mixを試料数+1分まとめて調製し、PCRチューブに10 µLずつ分注する。

Master Mix for 1 Amplification

µl*10 µl-1

Sterilized H2O7.1

dNTPs (2 mM each)0.8

PCR-Puffer (10 X)1.0

M13 Forward Primer (20µM)0.5

M13 Reverse Primer (20µM)0.5

Taq Polymerase0,1

２）ターゲットのコロニーをクリスタルチップで突つき、必要があれば別プレートにレプリカをとってから、１）の溶液に浸け、2-3回ピペッティング

３）チップを捨て、蓋を閉めてPCR反応

　94℃、3 min (1 cycle)

　94℃、30 s→55℃、30 s→72℃、α min* (30 cycle)

　4℃、hold (1 cycle)

　*挿入断片長1 kbあたり1分、1 kb未満の場合1分

４）loading dyeを加えて電気泳動して挿入断片長を確認する

簡便法

Colony PCR kit [例：Colony PCR M13 SET (Nippongene)] を用いると、反応終了後loading dyeを入れることなくそのまま電気泳動できる。この場合、Master Mix 1 mLあたりにSYBr Greenを1-2 µL加えておくと、泳動後そのまま結果を確認できる。多検体（96穴プレート）対象時には、分注用マイクロピペットを使って分注すると便利である。