PCR

（全ての操作は手袋をして、フィルター付きのチップを使って行うこと。水はオートクレーブしたての新鮮なものを。）

PCR-Mix for 1 Amplification of Bacteria DNA

                                                  µl / 25 µl

MilliQ H2O                              17.5

dNTPs (2 mM each)                  2.0

PCR-Buffer (10 X)                    2.5

Primer 1 (F984GC)                 0.4 (Heuer et al. 1997)

Primer 2 (R1378)                     0.4 (Heuer et al. 1997)

Taq Polymerase                         0.2

Mix (tapping)

Template                                   2.0 (5-20 ng)

Mix (tapping)

Primers

Primer sequence F984GC: 5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’  (bold= GC-clamp)

Primer sequence R1378-1401: 5’-CGG TGT GTA CAA GGC CCG GGA ACG-3’

The Primers* are specific for  a region of 16S rDNA of Bacteria.

*Refference: Heuer H, Krsek M, Baker P, Smalla K, Wellington E M H (1997): Analysis of Actinomycete Communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and Gel-Electophoretic separation in denaturing gradients. Applied and Environmental Microbiology 63, No 8, p 3233-3241)

PCR-Program

94oC, 5 min (1 cycle)

94oC, 30 sec

52oC, 1 min

72oC, 2 min (30-40 cycles)

72oC, 4 min

After the PCR:

5 µLのPCR-Product を使って、2% Agarose gel electrophoresisで増幅産物の確認をする.

きれいな像を得たい場合には、カラム精製を行う。

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Bufferは1x TAEを使用。水は全てMilli-Q、使用直前に採取すること。1.1と1.2のストック溶液はフィルターろ過した方がいい。

ゲル作成用アクリルアミドストック溶液（1.1, 1.2の両方必要）、4℃保存

      300-1000 bp200-400 bp

1.1        0% Denature Solution for    6% Gel       8% Gel

40 % Acrylamide/Bis                           15 mL          20 mL

50x TAE Buffer                                     2 mL            2 mL

H2O                                                     83 mL           78 mL

1.2     100% Denature Solution for    6 % Gel     8% Gel

Urea                                                      42 g              42 g

40 % Acrylamide/Bis                           15 mL           20 mL

50x TAE Buffer                                     2 mL             2 mL

Formamide                                           40 mL           40 mL

H2O                                           up to  100 mL   up to 100 mL

Urea is difficult to dissolve. Shake with stirrer bar in beaker with water using stirrer with heating. But slowly agitate and warm maximum at 40˚C.

16S rDNA用に設計された前述のプライマーセットを用いる場合には、500 bp程度の増幅産物が得られるので、6%用のゲル溶液を用いる方がよい。

泳動に使う機器はBio-RadのD-Code System。以下、この機器用の容量で記す

50x TAE Buffer

Tris base                          242 g

AcOH                             57.1 mL

0.5 M EDTA (pH 8.0)    100 mL

H2O                  up to     1000 mL

1x TAE Buffer for Buffer Tank

50x TAE Buffer             140 mL

H2O (Milli-Q)     up to 7000 mL

ゲルの作成

グラジエントゲル作成用の専用ユニットを使う。

L (Light), H (Heavy)の２種類の溶液を用意して、アクリルアミドを調製する。

＜作成前の準備＞

・ゲル板の洗浄（アルコールで磨く）、組立。ガラスが欠けている面は外側に。組み立て後は水平に調整すること

・100%  Denature Solutionは尿素が沈澱しているので、ヒーター付きスターラーで加熱しながら混ぜて溶解。40℃を超えないように注意する

＜アクリルアミド溶液の調製＞

変性剤35%:   L =  11 ml 0% Denature Solution  +    6 ml 100% Denature Solution

変性剤55%:   H = 7.6 ml 0% Denature Solution  + 9.4 ml 100% Denature Solution

50 mL容ファルコンチューブを使用。氷冷。

アクリルアミド溶液の調製が終わったら、以下の順序で試薬を投入、よく混ぜて次に進む。

１）100 µL  DGGEゲル勾配確認用色素液*（Ｈのみ）

２）150 µL  10% APS（冷凍保存）

３）  15 µL  TEMED

*DGGEゲル勾配確認用色素液

BPB 50mg, Xylene Cyanol 50 mgを10 mLの1 x TAE Bufferに溶解。4℃保存

＜密度勾配ゲルの作成＞

１）L, Hの溶液を別々の専用のシリンジで全て吸う。あまり泡が入らないように気をつける

２）シリンジにシリコンチューブを接続。空気を抜く。

３）ゲル作成ユニットにきちんと装着する。手前がL、奥がH。シリンジが最も右手に来て固定されていることを確認する

４）チューブを三又コネクタを用いて一本にまとめる。先端には注射針

５）最初の1 mL程度を捨ててから、ゲル板の中央に注射針を挿入

６）ゆっくりと回転台を回し、ゲル溶液を注入してゆく。均一の速度で、ゆっくりと。結構硬いので一気に行ってしまうことはないが、力の加減には注意

７）ゲル板の上部まで満たされたら、アルコールで拭ったコームを刺す。コームの下部に泡が入らないように注意する

８）２時間以上静置してゲル化。O/Nの時はMilli-Qで濡らした紙タオルを被せておく

電気泳動

　まず、電気泳動は時間が掛かるのでそれを見越した実験設計にする。泳動終了後はなるべく早く染色した方がよい。

１）泳動バッファーの作成（前述、７Ｌ必要）

２）泳動バッファーを予熱する（60℃）

３）泳動バッファーが暖まったら、ゲル板を泳動器具（上部バッファータンクになる器具）に装着する。

４）泳動槽のカバーにあるヒーターのスイッチをオフにしてから１分待ち、カバーを外す

５）350 mLの泳動バッファーをビーカーですくってから、ゲル板の着いた泳動器具を入れる。上部バッファータンクに350 mLの泳動バッファーを入れる

６）再度、予熱。60℃に達したらアプライ可能。作業中に温度が低下するのがいやな場合は65℃にセットしてもよい。この間に試料（約28µL）に泳動用色素*を8 µL入れる

７）泳動槽のカバーにあるヒーターのスイッチをオフにしてから１分待ち、カバーを外す

８）ウェルを洗浄。（シーケンサーのゲルでやるように）

９）サンプルアプライ。電気泳動試料をアプライするために先の細い専用チップを使用した方がうまくアプライしやすいと思われる

１０）電極の向きに留意して、カバーをセットする

１１）上部のカバーの電源を入れ、ヒーターとポンプをonにする。ヒーターは60℃にセット

１２）パワーサプライに接続し、90V, 16h (960 min)にセットしてスタート（早く終わらせたいときは150V, 5hも可。おそらくバンドが太くなるので解像度が落ちる）

*泳動用色素 (10mL、室温保存)

0.25 mL  20% BPB

0.25 mL  20% Xylene Cyanol

7.0  mL  80% Glycerol

2.5  mL  MilliQ

ゲルの銀染色

Bio-Radなどのキットを使ってもよい。下記の方法だと非常に安価にすむ

＜染色用試薬＞

すべて、水はMilliQを使う。必要量はゲル１枚当たり

・10% AcOH, 400 mL

・MilliQ, 2,000 mL

・銀染色液*, 200 mL

・現像液**, 400 mL

使用後は、銀染色液と現像液は専用の廃液入れに捨てること。その他は一般廃液。

*銀染色液（使用日に調製、室温）

0.2 g AgNO3を200 mLのMilliQに溶解。使用直前に0.3 mLのホルマリン(37% formaldehyde)を加えて混ぜてから使う

**現像液（使用日に調製、調製後は冷蔵庫で冷やしておく）

12 g                Na2CO3

80 µL              Sodium thiosulfate solution

                       (0.157 g Sodium thiosulfateをMilliQに溶解、10 mLにfill up、用時調製)

up to 400 mL  MillQ

使用直前に0.6 mLのホルマリン(37% formaldehyde)を加えて混ぜてから使う

＜染色の手順＞

１）泳動終了後、泳動装置を解体し、ゲル板を外す

２）ゲル板からゲルを外す。小さい方のガラスが上になるようにして、少しずらしたスペーサーをゆっくりと持ち上げるとゲルは大きい方のゲルにくっついて残る

３）予め10% AcOHを入れておいた容器内にゲルが載ったままのガラス板を入れ、ゆっくりとゲルを泳がすようにして溶液内に移す。剥がれたらゆっくりとガラス板を取り出す。

４）緩やかに振盪、30 min（固定）

５）溶液をビーカーに回収（あとでまた使う）。MilliQ 400 mLを入れる。緩やかに振盪、3 – 5 min

６）溶液を捨て、MilliQ 400 mLを入れる。緩やかに振盪、3 – 5 min

７）溶液を捨て、MilliQ 400 mLを入れる。緩やかに振盪、3 – 5 min。この間に銀染色液にホルマリンを加える

８）溶液を捨て、銀染色液200 mLを入れる。緩やかに振盪、30 min。この待ち時間の終わりには現像液にホルマリンを加える。

９）溶液を専用廃液入れに捨て、MilliQ 400 mLを入れる。短時間の洗浄。

１０）溶液を捨て、現像液 200 mLを入れる。茶色が現れてくるまで。

１１）溶液を専用の廃液入れに捨て、残りの現像液200 mLを入れる。バンドが十分に現れて、バックグラウンドが余り高くなってしまわないうちに止めるべきと思った段階で次に進む

１２）５）で回収した10% AcOHを加える。現像液と反応して泡立つが気にしない。緩やかに振盪、10 min

１３）溶液を専用の廃液入れに捨て、MilliQ 400 mLを入れる。緩やかに振盪、20 min

１４）OHP filmに載せて透過型スキャナの台に載せる。600 dpiの解像度でスキャンして、画像解析を行う。ゲルはある程度水を切った後、OHPフィルム２枚に挟んでセロテープで留めて、ファイルしておいておくことができる